Christensen Medio (Urea Agar Base).

Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica.
Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.


Fundamento

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Tripteína	1.0	Suspender 24 g de polvo en 950 ml de agua destilada. Dejar reposar 2 minutos. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 50°C y agregar 50 ml de una solución de urea al 40% previamente esterilizada por filtración o cloroformo. Fraccionar en tubos de hemólisis y solidificar en pico de flauta con fondo profundo.
Glucosa	1.0
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato monopotásico	2.0
Rojo de fenol	0.012
Agar	15.0
pH final: 6.8 ± 0.2

 

Siembra   

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación.
Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

Incubación     

En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °C.

Resultados

Microorganismo	Actividad ureásica	Color del medio
Proteus mirabilis ATCC 43071	Positiva	Rojo-Rosado
K. pneumoniae ATCC 700603	Positiva débil	Rojo-Rosado
Escherichia coli ATCC 25922	Negativa	Amarillo
S. flexneri ATCC 12022	Negativa	Amarillo
S. typhimurium ATCC 14028	Negativa	Amarillo

 

Limitaciones    

-Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación.
-No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente.

 

Características del medio

Medio preparado: amarillo

Almacenamiento

Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-109-05	x 500g :Código:  B02-109-06

Kligler Hierro Agar.(8/10/14)

 

 

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.

 

Fundamento

En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe ³⁺, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y  producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Peptona de carne	13.0	Suspender  54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitación frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolución total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.
Cloruro de sodio	5.0
Lactosa	10.0
Tripteina	10.0
Glucosa	1.0
Citrato de hierro y amonio	0.5
Tiosulfato de sodio	0.3
Rojo de fenol	0.025
Agar	15.0
pH final: 7.3 ± 0.2

 

Siembra

A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

 

Incubación

A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.

 

Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.

2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.

3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.

4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.

5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.

 

Microorganismo	Pico/Fondo	Producción de gas	Producción de ácido sulfhídrico
E. coli ATCC 25922	A/A	+	-
K. pneumoniae ATCC700603	A/A	+	-
P. mirabilis ATCC 43071	K/A	+	+
S. typhimurium ATCC 14028	K/A	-	+
S. enteritidis ATCC 13076	K/A	+	+
S. flexneri ATCC 12022	K/A	-	-
P. aeruginosa ATCC 27853	K/K	-	-

A: ácido

K: alcalino

Características del medio
Medio preparado: rojo

AlmacenamientoMedio deshidratado: a 10-35 ºC.

Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-234-05	x 500g :Código:  B02-234-06

Simmons Citrato Agar( 7/10/14)

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Citrato de sodio	2.0	Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato dipotásico	1.0
Fosfato monoamónico	1.0
Sulfato de magnesio	0.2
Azul de bromotimol	0.08
Agar	15.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.

Resultados 

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo	Citrato permeasa	Color del medio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Positivo	Azul
S. typhimurium ATCC 14028	Positivo	Azul
E. coli ATCC 25922	Negativo	Verde
S. flexneri ATCC 12022	Negativo	Verde

Limitaciones
-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo.
-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medio
Medio preparado: verde.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-132-05	x 500g :Código:  B02-132-06

 

Despues de analizar y comprender la información introductoria llegamos al punto cumbre del curso de microbiología de quinto semestre, primero que nada están algunas fichas técnicas de los medios de cultivo que utilizamos en nuestras practicas.

 

 

Estafilococo Medio 110.

 

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producción
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.


Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06).
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa,
obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Extracto de levadura	2.5	Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
Tripteína	10.0
Gelatina	30.0
Lactosa	2.0
D-Manitol	10.0
Cloruro de sodio	75.0
Fosfato dipotásico	5.0
Agar	15.0
pH final: 7.0 ± 0.2

 

Siembra Directa, en superficie, por estriado o por extensión. Incubación Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.

1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Microorganismo	Pigmento	Fermentación de manitol	Hidrólisis de la gelatina	Prueba de la coagulasa
S. aureus ATCC 25923	+	+	+	+
S. aureus ATCC 6538	+	+	+	+
S. epidermidis ATCC 14990	-	-	+	-

Notas:
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.

Limitaciones-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Almacenamiento
 
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-105-05	x 500g :Código:  B02-105-06