Simmons Citrato Agar( 7/10/14)

Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Citrato de sodio	2.0	Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar en posición inclinada.
Cloruro de sodio	5.0
Fosfato dipotásico	1.0
Fosfato monoamónico	1.0
Sulfato de magnesio	0.2
Azul de bromotimol	0.08
Agar	15.0
pH final: 6.9 ± 0.2

Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero , usando una ansa sin arrastrar el agar.

Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.

Resultados 

-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

Microorganismo	Citrato permeasa	Color del medio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603	Positivo	Azul
S. typhimurium ATCC 14028	Positivo	Azul
E. coli ATCC 25922	Negativo	Verde
S. flexneri ATCC 12022	Negativo	Verde

Limitaciones
-Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualización azul de un resultado positivo.
-Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
-Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos.

Características del medio
Medio preparado: verde.

Almacenamiento
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-132-05	x 500g :Código:  B02-132-06

 

Despues de analizar y comprender la información introductoria llegamos al punto cumbre del curso de microbiología de quinto semestre, primero que nada están algunas fichas técnicas de los medios de cultivo que utilizamos en nuestras practicas.

 

 

Estafilococo Medio 110.

 

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciación presuntiva de estafilococos, en base a la producción
de pigmentos, la fermentación de manitol y la hidrólisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.


Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicación alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios sólidos selectivos: Baird Parker Medio (B02-141-05/06), Manitol Salado Agar (B02-118-05/06), o Estafilococo Medio 110 (B02-105-05/06).
En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la tripteína aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentración, para inhibir el desarrollo de la flora acompañante excepto Staphylococcus spp., lográndose así un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos.
Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa,
obtener pruebas de identificación presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentación de manitol e hidrólisis de la gelatina.

Fórmula (en gramos por litro)		Instrucciones
Extracto de levadura	2.5	Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.
Tripteína	10.0
Gelatina	30.0
Lactosa	2.0
D-Manitol	10.0
Cloruro de sodio	75.0
Fosfato dipotásico	5.0
Agar	15.0
pH final: 7.0 ± 0.2

 

Siembra Directa, en superficie, por estriado o por extensión. Incubación Durante 48 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.

Resultados Observar las características de las colonias y realizar las pruebas de identificación de microorganismos.

1-Fermentación de manitol: agregar unas gotas de púrpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas.

Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio.

Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.
2-Hidrólisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 ºC, en aerobiosis durante 10 minutos.

Positiva: halo transparente alrededor de las colonias.

Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Microorganismo	Pigmento	Fermentación de manitol	Hidrólisis de la gelatina	Prueba de la coagulasa
S. aureus ATCC 25923	+	+	+	+
S. aureus ATCC 6538	+	+	+	+
S. epidermidis ATCC 14990	-	-	+	-

Notas:
“Realización de la Prueba de la coagulasa”: agregar a 0,5 ml de plasma heparinizado (preferentemente de conejo o humano), igual volumen de un cultivo de 24 horas en Cerebro Corazón Infusión (B02-146-05/06), obtenido a partir de las colonias sospechosas. Incubar a 35-37 °C durante 2 a 3 horas, en aerobiosis. Los estafilococos coagulasa positivos forman un coágulo antes de ese período.

Limitaciones-Algunas cepas de Enterococcus faecalis, fermentadoras de manitol, pueden desarrollar en este medio.
-Para realizar la prueba de la coagulasa, se aconseja subcultivar las colonias sospechosas en medios sólidos o líquidos no selectivos, por ejemplo: Agar Nutritivo, Infusión Cerebro Corazón, Triptosa Fosfato Caldo, debido a que si se realiza directamente de este medio de cultivo, puede afectarse la detección por el alto contenido de cloruro de sodio.

Características del medioMedio preparado: ámbar claro, opalescente con precipitado.

Almacenamiento
 
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

Presentación
x 100g :Código:  B02-105-05	x 500g :Código:  B02-105-06

Tarea de investigación: Como se lleva a cabo una esterilización ultravioleta en el laboratorio. (Investigación aplicada por la profesora para fortalecer los conocimientos)

 

 

Las radiaciones electromagnéticas ionizantes son una forma de esterilización física muy efectiva pero su manejo se ve restringido por la necesidad de disponer de instalaciones especiales para la emisión radioactiva. Durante las prácticas se manejará material adquirido de casas comerciales esterilizado mediante radiación γ, una radiación muy penetrante y útil para la esterilización de material termolábil como el plástico.

 

En el laboratorio de prácticas utilizaremos la luz ultravioleta (UV) cuyo efecto biocida se debe a que provoca la formación de dímeros de timina en el DNA. Esta radiación tiene muy baja capacidad de penetración por lo que su uso se ve restringido al tratamiento de superficies o a la esterilización del aire en "salas limpias" como los quirófanos o las instalaciones como las unidades de cultivo celular.

 

Material necesario: 

• Cultivo mixto
• Placa con agar nutritivo
• Papel de aluminio
• Lámpara de luz ultravioleta germicida

Procedimiento:

 

·         Inocular mediante un agotamiento de asa un cultivo mixto en una placa con agar nutritivo.

 

·         Posteriormente, levantar la tapa y cubriremos la mitad con el papel de aluminio (sin que éste toque la superficie del medio). 

 

·         Colocar la placa abierta bajo la acción de la lámpara ultravioleta durante 5 minutos.

 

·         Transcurrido este tiempo, quitar el papel de aluminio, cerrar la placa y llevar a Incubar a 37ºC.

 

·         Tras 24 horas de incubación observar el desarrollo microbiano en la parte protegida de la radiación, frente a la ausencia de crecimiento en la parte expuesta.

 

Tarea de investigación: Beneficios que trae la E. Coli.( investigación aplicada por la profesora para fortalecer nuestros conocimientos)

Escherichia coli

Definición:

 

Es una bacteria común que vive en los intestinos de animales y humanos. Existen muchas cepas de ‘E. coli’, inofensivas en su mayoría, aunque existe una variedad, ‘E. coli’ 0157: H7 que produce una potente toxina (Shiga) y puede ocasionar enfermedades graves como el Síndrome Urémico Hemolítico, que puede acabar en fallo renal.

La combinación de letras y números en el nombre de la bacteria se refiere a los marcadores específicos que se encuentran en su superficie y la distingue de otros tipos de ‘E. coli’.

Beneficios:

• La obtención de insulina por medio de la Escherichia coli. La insulina antes se tomaba de la vaca y del cerdo, por ser su estructura similar, sin embargo, mucha gente presentaba reacciones alérgicas, hasta que utilizaron la biotecnología y tomaron el gen humano de la insulina y lo insertaron en la Escherichia coli (la eligieron por ser muy fácil de mantener y su rápida reproducción). Entonces cada 20 minutos la población de bacterias se duplicaba y así ella producía la insulina humana. Por supuesto ya la gente no presenta reacciones alérgicas.

• Otro beneficio es que ayuda a mantener el equilibrio en la flora intestinal normal, contra las bacterias nocivas y, sintetiza o produce algunas vitaminas.

 

 

  

 

 

 

 

Después de conocer los métodos de esterilización y algunos conceptos claves, pasamos a la preparación del antibiograma que es otra actividad primordial para la preparación de medios de cultivo.( La fecha de preparación del antibiograma fue el 11/09/14))

 

Preparación del antibiograma






 

 

Diagrama de flujo

Diagrama de flujo

 

 ¿Qué son los antibióticos?

Se denomina Antibiótico a cualquier compuesto químico utilizado para eliminar o inhibir el crecimiento de organismos infecciosos.

 Una propiedad común a todos los antibióticos es la toxicidad selectiva: la toxicidad hacia los organismos invasores es superior a la toxicidad frente a los animales o seres humanos. La penicilina es el antibiótico más conocido, y ha sido empleado para tratar múltiples enfermedades infecciosas, como la sífilis, la gonorrea, el tétanos o la escarlatina.

 La estreptomicina es otro antibiótico que se emplea en el tratamiento de la tuberculosis. En un principio, el término antibiótico sólo se empleaba para referirse a los compuestos orgánicos producidos por bacterias u hongos que resultaban tóxicos para otros microorganismos.

 En la actualidad también se emplea para denominar también compuestos sintéticos o semisintéticos. La principal categoría de antibióticos son los antibacterianos, pero se incluyen los fármacos antipalúdicos, antivirales y antiprotozoos.







 

 

Otra de las cosas primordiales que aprendimos en el laboratorio de microbiología fueron los métodos de esterilización:

 

·         Calor húmedo: Autoclave

·         Calor seco: Estufa

AUTOCLAVE

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

 

Equipo:

 

 

Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica, esta se cierra en la parte superior por una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

 

Funcionamiento:

 

 

Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla de metal. Se cierra asegurando la tapa, sin ajustar los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salidÔ9de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

 

Ventajas del calor húmedo:

 

·         Rápido calentamiento y penetración

·         Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo

·         No deja residuos tóxicos

·         Hay un bajo deterioro del material expuesto

·         Económico

Desventajas:

 

·         No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

·         Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

 

ESTUFA

 

El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

 

Estufas

 

 

Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.

Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal, que al dilatarse por el calor, cortan el circuito eléctrico.

 

Ventajas del calor seco:

 

•  No es corrosivo para metales e instrumentos.

•  Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Desventajas:

 

• Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

Conceptos relacionados :

 Asepsia y antisepsia comprenden un conjunto de procedimientos, en cualquier trabajo que involucre al ser humano, aunque este concepto no haya sido siempre dominante. Hasta 1867, se llegó a la conclusión de que las infecciones eran causadas por “algo”. En 1878, Pasteur define en términos claros, que las infecciones eran causadas por gérmenes específicos para cada tipo de enfermedades.
Asepsia: es un conjunto de procedimientos que tienen por objeto impedir la penetración de gérmenes en el sitio que no los contenga.
Antisepsia: es la destrucción de los gérmenes por medio del empleo de antisépticos.
Los medios de que disponemos para la aplicación de los principios de estos dos procedimientos descritos, se consiguen a través de la esterilidad y la desinfección del ambiente de trabajo, del instrumental utilizado, así como del campo operatorio.